Что такое полимеразная цепная реакция (ПЦР)? факты о тесте, шаги и используемые для

Что такое ПЦР (полимеразная цепная реакция)?

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) - это метод, который используется для амплификации следовых количеств ДНК (и в некоторых случаях РНК), расположенных в или почти на любой жидкости или поверхности, где могут откладываться нити ДНК. Ключом к пониманию ПЦР является знание того, что каждый человек, животное, растение, паразит, бактерия или вирус содержат генетический материал, такой как последовательности ДНК (или РНК) (нуклеотидные последовательности или фрагменты ДНК или РНК), которые являются уникальными для их видов, и для отдельного члена этого вида. Следовательно, если образец содержит сегменты ДНК или РНК, ПЦР - это метод, используемый для амплификации (создания намного большего числа идентичных копий) этих уникальных последовательностей, чтобы затем их можно было использовать для определения с очень высокой вероятностью идентичности источника ( конкретный человек, животное или патогенный организм) следовых ДНК или РНК, обнаруженных в или почти на любом образце материала.

Однако ПЦР-амплификация является лишь частью идентифицирующего теста. После завершения амплификации (см. Ниже) амплифицированные сегменты необходимо сравнивать с другими нуклеотидными сегментами из известного источника (например, конкретного человека, животного или патогенного организма). Такое сравнение уникальных сегментов часто выполняется путем помещения нуклеотидных последовательностей, генерируемых ПЦР, рядом с известными нуклеотидными последовательностями людей, патогенов или других источников в разделяющий гель. Электрический ток проходит через гель, и различные нуклеотидные последовательности образуют полосы, которые напоминают «лестницу» в зависимости от их электрического заряда и размера молекулы. Это называется гель-электрофорезом. Полосы или «лестничные» ступени, которые мигрируют до тех же уровней в геле, показывают идентичность нуклеотидных последовательностей. Этот метод является одним из самых популярных способов проведения ПЦР-тестов (см. Рис. 1).

Рисунок 1, Полосы или «лестничные» ступени ПЦР, полученные ДНК микобактерий (любезно предоставлены CDC)

Рис. Схемы повторяющихся элементов (Rep) –PCR (A) и гель-электрофореза в импульсном поле (PFGE) (B) изолятов Mycobacterium cosmeticsum от 2 пациентов в Огайо и 1 пациента в Венесуэле. Rep-PCR проводили с использованием праймера BOXA1R (3), а PFGE проводили с рестриктазой AseI. Дорожки 1, 2, Огайо изолируют ОН1 и ОН2; дорожки 3, 4, контрольные штаммы ATCC BAA-878T и ATCC BAA-879; полоса 5, венесуэльский изолят VZ1. Стандарты размера ДНК - маркер 100 п.н. (S1) и маркер 48, 5 п.н. (S2).

Как проводится ПЦР (полимеразная цепная реакция)?

В 1983 году Кэри Маллис выяснил основные этапы амплификации последовательностей ДНК. Он и Майкл Смит были удостоены Нобелевской премии за разработку этой процедуры в 1993 году. Есть несколько основных шагов, которые выполняются последовательно; ПЦР можно проводить в одной пробирке с соответствующими химикатами и специально разработанным нагревателем. Необходимые реагенты или химикаты:

• Образец, содержащий нуклеотидную последовательность (из крови, волос, гноя, соскоба кожи и т. Д.)
• ДНК-праймеры: короткая одноцепочечная ДНК, которая присоединяется к нуклеотидным последовательностям, которая способствует синтезу комплементарной цепи нуклеотидов.
• ДНК-полимераза: фермент, который, когда ДНК имеет связанный с праймером, идет вниз по сегменту ДНК, прикрепляя строительные блоки ДНК, чтобы сформировать комплементарные пары оснований и таким образом синтезирует комплементарную цепь нуклеотидов ДНК (введение термостойкой ДНК-полимеразы, Taq полимераза, полученная из термостойких бактерий, заметно улучшила способность проводить ПЦР)
• В растворе присутствует большой избыток строительных блоков ДНК, называемых нуклеотидами (аденин, тимидин, цитозин и гуанин, сокращенно обозначенные как A, T, C и G соответственно). Когда эти блоки связаны друг с другом, они образуют нуклеотидную последовательность или одну цепь ДНК. Когда эти строительные блоки связывают свои комплементарные строительные блоки слабыми водородными связями (например, A будет связываться только с T, а G только с C), образуется нуклеотидная последовательность комплементарной ДНК, которая связывается с исходной одноцепочечной ДНК. Когда связывание завершено, в определенной последовательности образуется комплементарная двухцепочечная ДНК.

Затем ПЦР начинается с сегмента ДНК из образца, который помещается в пробирку с реагентами, перечисленными выше. Раствор нагревают по меньшей мере до 94 ° С (201, 2 ° F); этот нагрев разрушает водородные связи, которые позволяют формировать комплементарные нити ДНК, поэтому в смеси существуют только одиночные нити (это называется денатурацией двухцепочечной ДНК).

Смеси дают остыть до примерно 54 ° С (129, 2 ° F). При этой температуре ДНК-праймеры и ДНК-полимераза связываются с индивидуальной одноцепочечной ДНК (это называется отжигом ДНК). Поскольку строительные блоки находятся в избытке (высокая концентрация) в смеси, полимераза использует их для создания новых комплементарных цепей ДНК (называемых удлинением ДНК), и этот процесс происходит быстрее при 72 ° C (161, 6 ° F). Этот процесс создает новую молекулу двухцепочечной ДНК из каждой из отдельных цепей исходной молекулы.

Этот цикл повторяется примерно 40 раз в машине, называемой термоциклером, которая автоматически повторяет циклы нагревания-охлаждения, причем количество каждой последовательности ДНК удваивается каждый раз, когда цикл нагревания-охлаждения завершается. То, что изначально представляло собой один короткий сегмент ДНК, может быть увеличено примерно до 100 миллиардов копий после 40 циклов удвоения.

Зачем врачу назначать ПЦР (полимеразную цепную реакцию) тест?

ПЦР-тест лежит в основе ряда тестов, которые могут ответить на множество различных медицинских вопросов, которые помогают врачам диагностировать и лечить пациентов. Например, тесты ПЦР могут выявлять и идентифицировать патогенные организмы у пациентов, особенно те, которые трудно культивировать (например, ВИЧ и другие вирусы и некоторые грибы).

Другие врачи заказывают ПЦР-тесты для диагностики генетических заболеваний, в то время как другие врачи используют ПЦР для выявления биологических связей, таких как идентификация родителей детей. ПЦР-тесты также используются для выявления и характеристики генетических мутаций и перестроек, обнаруженных при определенных видах рака.

Тем не менее, ПЦР-тесты были изменены и распространены на многие аспекты научных исследований, включая эволюционную биологию, генетические дактилоскопии, криминалистические исследования и многие другие.

Что такое RT-PCR?

ОТ-ПЦР - это тест ПЦР, предназначенный для обнаружения и измерения РНК. Хотя первоначальные ПЦР-тесты усиливали ДНК, многие вирусы и другие биологические компоненты (например, митохондрии) используют РНК в качестве своего генетического материала. ОТ-ПЦР отличается от обычной ПЦР тем, что сначала берет РНК и превращает цепь РНК в цепь ДНК. Это делается по существу тем же способом для ПЦР, который описан выше, за исключением использования фермента, называемого обратной транскриптазой, вместо ДНК-полимеразы. Обратная транскриптаза позволяет транслировать одну цепь РНК в комплементарную цепь ДНК. Как только эта реакция происходит, обычный метод ПЦР может быть использован для амплификации ДНК. ОТ-ПЦР была использована для обнаружения и изучения многих РНК-вирусов.

ОТ-ПЦР не следует путать с другим вариантом ПЦР, называемым ПЦР в реальном времени. ПЦР в реальном времени представляет собой разновидность ПЦР, которая позволяет анализировать амплифицированную ДНК в течение обычных 40 циклов процедуры. Хотя процедура похожа на обычную ПЦР с циклическим циклом, в ПЦР в реальном времени используются флуоресцентные красители, прикрепленные к некоторым строительным блокам или небольшим нитям нуклеотидов. В зависимости от используемого метода, флуоресценция происходит, когда образуются амплифицированные цепи ДНК. Количество флуоресценции может быть измерено в течение 40 циклов и позволяет исследователям измерять конкретные продукты и их количества во время циклов амплификации. Это часто позволяет исследователям или лаборантам пропустить гель-электрофорез или другие вторичные процедуры, необходимые для анализа продуктов ПЦР, что дает более быстрые результаты.

ПЦР в реальном времени и ОТ-ПЦР являются вариациями или модификациями исходного теста ПЦР. Однако существует еще много вариаций (не менее 25), которые используются для решения конкретных проблем. Все они имеют разные названия, такие как сборочная ПЦР, ПЦР с горячим пуском, мультиплексная ПЦР, твердофазная ПЦР и многие другие.

ПЦР, вероятно, будет продолжать изменяться, чтобы помочь ответить на любые другие вопросы в области медицины, биологии. и другие области исследования.